Диагностика карантинных вирусов рода Nepovirus методом количественной ПЦР
Род Nepovirus включает в себя 36 видов вирусов, поражающих растения. Геном вирусов этой группы представлен одноцепочечной РНК, состоящей из двух сегментов. Характерной особенностью неповирусов является тот факт, что их переносчиками служат нематоды. Ряд вирусов из этого рода внесен в Перечень карантинных объектов Российской Федерации, среди них — вирус кольцевой пятнистости томата (ВКПТом, ToRSV), вирус кольцевой пятнистости табака (ВКПТ, TRSV), вирус черной кольцевой пятнистости картофеля (ВЧКПК, PBRSV). Вирус кольцевой пятнистости малины (RpRSV, ВКПМ) внесен в список регулируемых некарантинных вредных организмов Российской Федерации.
Вирусы кольцевой пятнистости томата (ВКПТом) и кольцевой пятнистости табака (ВКПТ) являются эндемичными североамериканскими вирусами, но в настоящее время распространились и на других континентах. ВКПТом имеет в Северной Америке широкий круг природных растений-хозяев из 35 семейств, включая древесные и кустарниковые виды, а также одно и многолетние травянистые растения. Вирус известен в качестве возбудителя ряда опасных болезней косточковых культур: крапчатости листьев черешни, желтой мозаики почек персика, ямчатости древесины косточковых, коричневой линии на спайке сливы. ВКПТом поражает также яблоню, виноград, малину, ежевику, землянику, голубику, красную и черную смородину, крыжовник, миндаль и многочисленные виды кустарниковых и травянистых декоративных растений. Среди поражаемых однолетних овощных культур этот вирус наиболее вредоносен на томате, огурце, тыкве и фасоли.
Естественными хозяевами вируса кольцевой пятнистости табака являются 89 видов растений из 27 ботанических семейств. Вирус вызывает серьезные болезни сои, табака, винограда, голубики и тыквенных культур. В число природных растений хозяев ВКПТ входят яблоня, черешня, виноград, различные ягодные, многочисленные овощные, бахчевые и зернобобовые культуры, древесные, кустарниковые и травянистые декоративные растения.
ВКПТом и ВКПТ поражают также несколько видов сорных растений, которые могут являться резерваторами инфекции [6].
Имеются отдельные сообщения о выявлении ВКПТом и ВКПТ на разных растениях в Российской Федерации, в связи с чем оба этих патогена включены в список А2 (ограниченно распространенных) Перечня карантинных объектов нашей страны [1, 2, 5].
Вирус черной кольцевой пятнистости картофеля (ВЧКПК) в настоящее время достоверно выявлен лишь в Перу, но, очевидно, распространен и в других андийских странах. Вредоносный патоген картофеля. Потенциальными растениями хозяевами этого вируса являются также 40 видов из 11 ботанических семейств, что подтверждено путем искусственного заражения [6]. Наряду с другими андийскими вирусами картофеля ВЧКПК включен в список А1 (отсутствующих) карантинных объектов Российской Федерации.
Вирус кольцевой пятнистости малины (ВКПМ) распространен в ряде стран Европы. Наряду с малиной и ежевикой поражает землянику, смородину, крыжовник, виноград, различные виды косточковых культур, многочисленные цветочные и овощные культуры. В нашей стране его неоднократно выявляли на ягодных и декоративных культурах [3, 4].
Для проведения постоянного мониторинга растений и посадочного материала на зараженность карантинными вирусами рода Nepovirus требуется разработка быстрых, высокочувствительных и специфичных методов диагностики. Классический метод с использованием растенийиндикаторов имеет ряд существенных недостатков, в частности, требует высокой квалификации персонала и значительных затрат времени; характеризуется низкой производительностью и недостаточной чувствительностью.
Для выявления ВКПТом, ВКПТ, ВЧКПК и ВКПМ используется также метод иммуноферментного анализа (ИФА), но антисыворотки к этим вирусам в России не производятся.
А — система на ВЧКПК,
Б — система на ВКПТ,
В — система на ВКПТом,
Г — система на ВКПМ.
Номера дорожек соответствуют номерам в таблице.
Дорожки 9 — положительные контроли, «-» — отрицательный контроль (вода).
Современной альтернативой традиционным методам диагностики является использование молекулярных технологий, в первую очередь ПЦР (полимеразной цепной реакции) и ее модификаций. Они позволяют быстро, с высокой чувствительностью и специфичностью определять наличие анализируемого вируса даже при латентной инфекции и низком содержании в образце. Специфичность тест-систем на основе ПЦР обеспечивается уникальными для каждого организма сайтами посадки коротких олигонуклеотидных затравок (праймеров). Модификации ПЦР с использованием интеркалирующих флуоресцентных красителей либо флуоресцентномеченых зондов, для которых в настоящее время применяется общий термин «количественная ПЦР» (кПЦР) [7], позволяет также проводить количественный анализ содержания целевой ДНК в пробе. Кроме того, использование данного подхода позволяет проводить анализ результатов, не открывая пробирки с продуктами амплификации, и тем самым исключая вероятность контаминации рабочего пространства продуктами амплификации. Тесты на основе кПЦР являются оптимальным решением для рутинного анализа больших объемов материала, в том числе в карантинных организациях. Общая схема проведения анализа универсальна и включает в себя выделение РНК, реакцию обратной транскрипции, проведение кПЦР и детекцию результатов. Общее время анализа в таком варианте, как правило, не превышает 3 ч.
Для дизайна праймеров, специфичных к четырем диагностируемым неповирусам, а также флуоресцентномеченых гидролизуемых зондов (TaqMan [8]) использовался фрагмент 1-го сегмента РНК. Испытание диагностических наборов проводили с референтными изолятами ВКПТом, ВКПТ, ВЧКПК и ВКПМ из немецкой коллекции фитопатогенов (DSMZ):
- ВКПТ — PV0234, PV0235 и PV0236,
- ToRSV — PV0049, PV0380 и PV0381,
- RpRSV — PV0429, PBRSV — PV0056.
Специфичность разработанных диагностических наборов оценивали с референтными изолятами других вирусов, относящихся к роду Nepovirus:
- мозаики резухи (ArMV, ВМР),
- черной кольчатости томата (TBRV, ВЧКТ),
- скручивания листьев черешни (CLRV, ВСЛЧ),
- близкородственного вируса латентной кольцевой пятнистости земляники (SLSRV, ВЛКПЗ).
Выделение РНК проводили с использованием набора «Проба-НК» (ООО «АгроДиагностика») в соответствии с протоколом производителя. Количественную ПЦР проводили в детектирующем амплификаторе ДТ-96 (ЗАО «НПФ ДНК-Технология») по следующей универсальной программе амплификации:
- 94°С — 1 мин;
- 94°С — 10 с,
- 55°С — 20 с,
- 72°С — 10 с (45 циклов) в реакционной смеси общим объемом 35 мкл, содержащей специфические праймеры в концентрации 0,4 мМ и флуоресцентномеченые зонды в концентрации 0,2 мМ. После окончания реакции продукты амплификации разделяли в 2% агарозном геле в присутствии бромистого этидия.
Для анализа результатов количественной ПЦР использовался пороговый метод, основанный на определении момента в ходе реакции (пороговый цикл, Сq), выраженного в циклах ПЦР, когда флуоресцентный сигнал (канал FAM) начинает превышать пороговую, или фоновую величину (Ребриков и др., 2009). Каждая из систем построена по принципу мультиплексной ПЦР: помимо специфического образца, в состав реакционной смеси входил внутренний контроль, состоящий из плазмиды-матрицы, пары праймеров и гидролизуемого зонда, позволяющий выявлять возможное ингибирование реакции и другие ошибки, приводящие к ложноотрицательному результату. Флуоресценция ВК детектируется на канале HEX. Таблица представляет собой протокол детекции четырех исследуемых вирусов в образцах зараженных растений.
Таким образом, положительный сигнал детектировался только в тех образцах, в которых присутствовала кДНК целевых вирусов, что является экспериментальным подтверждением специфичности разработанных наборов. Для каждой из четырех разработанных пар праймеров был сконструирован положительный контрольный образец (+ контроль), представляющий собой плазмиду, содержащую специфический фрагмент. С помощью ПЦР-анализа последовательных разведений положительных контрольных образцов был определен предел чувствительности тестсистем, который составил от 10 до 100 копий целевой кДНК на реакцию.
На рисунке представлены электрофореграммы продуктов ПЦР, на которых видны ампликоны, соответствующие ВК (560 п. н.), а также специфические продукты амплификации (366 п. н. — для ВЧКПК, 372 п. н. — для ВКПТ, 332 п. н. — для ВКПМ, 325 п. н. — для ВКПТом).
Диагностические наборы, созданные на основе разработанных тест-систем, имеют ряд характеристик, обеспечивающих возможность их использования в рутинных анализах, в частности, в практике карантинных лабораторий. Для предотвращения неспецифического отжига праймеров при низкой температуре и обеспечения сохранности наборов ПЦР-смесь разделена парафином разного цвета, что также обеспечивает маркировку пробирок разных тестсистем. Результаты исследований убедительно показывают, что использование наборов производства ООО «АгроДиагностика» позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать четыре вируса, три из которых входят в Перечень карантинных объектов РФ.
